Отчет об испытании дезинфицирующей активности средства «Триосепт-эндо»
«ТРИОСЕПТ-ЭНДО», Е. COLI, ST. AUREUS, ВИРУС АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ, ДЕЗИНФИЦИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ, ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ, БИОПРОБА
Объект исследований: дезинфицирующее средство «Триосепт- Эндо» производства ООО «НПО СпецСинтез».
Цель работы: изучение дезинфицирующего действия средства «Триосепт-Эндо» в отношении вируса АЧС.
В лабораторных условиях исследованы бактериостатическая и минимальная бактерицидная концентрации средства «Триосепт-Эндо» с использованием тест-микроорганизмов 1, 2 групп устойчивости, снижение активности дезинфицирующего средства в присутствии высокомолекулярного белка и испытана эффективность его дезинфицирующего действия при обеззараживании контаминированных вирусом АЧС поверхностей, имитирующих объекты животноводческих помещений и транспортных средств, с подтверждением полноты инактивации вируса постановкой биопробы на восприимчивых животных.
В системе санитарных, противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий, обеспечивающих благополучие страны по инфекционным болезням, повышение продуктивности животных и санитарное качество продуктов, сырья и кормов животного происхождения, дезинфекция занимает одно из важных мест. Под дезинфекцией понимают уничтожение на объектах внешней среды или удаление из них патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Основное назначение дезинфекции — разорвать эпизоотическую цепь путем воздействия на ее важнейшее звено — фактор передачи возбудителя болезни от источника инфекции к восприимчивому организму.
В последние годы на рынке дезинфицирующих средств представлен весьма большой ассортимент препаратов как отечественного, так и зарубежного производства, поскольку постоянный поиск и разработка новых дезсредств стимулируется непрерывно возрастающими запросами ветеринарии и других областей народного хозяйства. Но при всем многообразии биоцидов, количество компонентов, входящих в их состав, весьма ограничено, причем целый ряд соединений обладает высокой бактерио- и вирусстатической активностями и низким бактерицидным и вирулицидным действием, что не позволяет им эффективно обеззараживать контаминированные поверхности, особенно загрязненные органическими веществами. Особую актуальность проблема внедрения новых высокоэффективных дезинфектантов приобрела в последние годы, в связи с продолжающимся распространением по территории РФ занесенной в 2007 году африканской чумы свиней, представляющей реальную угрозу свиноводству страны. С 2007 года (первая вспышка) африканская чума свиней (АЧС) распространилась на 35 субъектов Российской Федерации. Пали и вынуждено убиты более 1 млн. голов домашних свиней и около 50 тыс. диких кабанов. Прямой ущерб для агропромышленного комплекса РФ составил более 30 млрд, рублей.
При АЧС отсутствуют средства специфической профилактики и, как показал анализ эпизоотических вспышек болезни, ведущую роль в их возникновении играет «человеческий фактор» т.к. вирус АЧС перевозится различными видами транспорта из одного региона в другой, очевидно, что в предотвращении дальнейшего распространения болезни одним из важнейших мероприятий является проведение эффективной дезинфекции.
Учитывая то, что для большинства дезинфектантов не определена их вирулицидная активность в отношении вируса АЧС, для изучения дезинфицирующего действия при АЧС представлен препарат «Триосепт- Эндо».
- 1 ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ
Дезинфицирующее средство «Триосепт-Эндо» производства ООО «НПО СпецСинтез».
Средство представляет собой прозрачную бесцветную жидкость. Содержит в своем составе в качестве действующих веществ глутаровый альдегид — 10,5 %, глиоксаль — 5,5 %, феноксиэтанол — 2,0 %, дидецилдиметиламмония хлорид — 6,5 % , а также ингибитор коррозии, неионогенные ПАВ и функциональные добавки.
Срок хранения концентрата 3 года.
- 2 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ
Определить спектр антимикробного действия средства «Триосепт- Эндо» в отношении тест-микроорганизмов 1, 2 групп устойчивости.
Определить дезинфицирующую активность средства «Триосепт- Эндо» в отношении вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней (АЧС) на контаминированных вирусом поверхностях, имитирующих объекты государственного ветеринарного надзора (на модели шероховатых впитывающих тест-поверхностей из бетона).
- 3 ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Испытания проводили в рамках договора № 07/14 от 24.02.2014 г. с ООО «НПО СпецСинтез» в период с 25 февраля по 28 апреля 2014 года в соответствии с руководством «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности», Р 4.2.2643-10 утвержденному Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 01.06.2010 г., «Методическим указаниям о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики», утвержденным ГУ В Госагропрома СССР в 1987 г, с использованием биопробы и методическим указаниям «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», МУК 4.2.1890-04, утвержденным Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 04.03.2004 г.
- 4 ОЦЕНИВАЕМЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Инфекционную активность вируса АЧС изолят Ставрополь оценивали в перевиваемой культуре клеток А4С2.
Минимальные бактериостатическую и бактерицидную концентрации средства «Триосепт-Эндо» определяли с использованием тест-культур Staphylococcus aureus и Escherichia coli.
Дезинфицирующее действие средства «Триосепт-Эндо» на вирусе АЧС оценивали с использованием тест-объектов, имитирующих поверхности животноводческих помещений и транспортных средств из впитывающих материалов, наиболее трудно поддающихся обеззараживанию (шероховатые впитывающие поверхности) и постановкой биопробы на подсвинках массой 18-25 кг.
- 5 МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЙ
5.7 Получение культур тест-микроорганизмов и приготовление инокулюма бактериальной культуры
Восстановление культур Staphylococcus aureus и Escherichia coli из лиофилизированного состояния проводили путем засева содержимого ампул в дрожжевой триптон-соевый бульон (ДТСБ). В пробирки со скошенным дрожжевым триптон-соевым агаром (ДТСА) засевали предварительно проверенные на отсутствие посторонней контаминации бактериальной и грибной микрофлорой культуры S. aureus и Е. coli в посевных дозах 103-106 м.т. Посевы инкубировали при температуре (36±1)°С в течение 18-20 ч. Выросшие суточные культуры контролировали на отсутствие контаминантов. Для этой цели из полученных культур готовили мазки, окрашивали по Граму и подвергали световой микроскопии. После визуальной и инструментальной (микроскопия) оценки микробиологической чистоты и типичности роста тест-микроорганизма проводили смыв бактериальной массы с поверхности агара. С использованием денситометра DEN-1 концентрацию микробных клеток в суспензиях доводили до 0,5 ЕД MF (106 м.т./см3) для тестировании антимикробной активности
- 5.2 Определение бактериостатической, бактерицидной активности дезинфекционного средства «Триосепт-Эндо» и влияния на их уровень высокомолекулярного белка
Предварительную оценку бактерицидного и бактериостатического действия средства «Триосепт-Эндо» проводили методом серийных разведений согласно методическим указаниям «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», МУК 4.2.1890-04 в нашей модификации. Для этого готовили серийные двукратные разведения испытуемого средства на дрожжевом триптон- соевом бульоне (ДТСБ) от 0,5 % до 0,0009% в объеме 2,0 мл.
В приготовленные разведения средства вносили инокулюм одной из культур в объеме 0,2 мл и инкубировали при температуре 37°С.
Результаты учитывали визуально через 18-20 часов инкубации при 37°С по появлению роста культуры в пробирках (бактериостатическое действие). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли по наименьшей концентрации средства, которая подавляла видимый рост тест-микроорганизма.
Контролем служили бульонные культуры микроорганизмов, в которые препарат не вносился.
Бактерицидное действие средств изучали по окончании исследований по определению бактериостатического действия. Для этого из пробирок, в которых видимый рост отсутствовал, по 0,2 мл высевали на ДТСА. Посевы инкубировали при 37°С. Учет результатов проводили через 18-24 часа инкубирования и затем через 5 суток.
Минимальную бактерицидную дозу определяли по наименьшей концентрации средства, при которой отсутствовал рост микроорганизма на ДТСА.
Для изучения влияния высокомолекулярного белка на антимикробную активность проводили аналогичные испытания с добавлением в МПБ нормальной сыворотки крови лошади в конечной концентрации 40 %.
- 5.3 Определение инфекционной активности вируса АЧС в культуре клеток
Для определения инфекционной активности вируса АЧС готовили десятикратные последовательные разведения вируссодержащей крови на среде Игла-МЕМ (с 10-1 до 10-8), которые вносили в 4 пластиковых культуральных флакона объёмом 25 см3 с 1-2-х суточной культурой клеток А4С2. Инфицированную культуру А4С2 инкубировали в СО2 инкубаторе при (37±0,5)°С в течение 6-7 суток. Наличие вируса в инфицированной культуре клеток определяли по феномену гемадсорбции (адсорбция эритроцитов свиней на инфицированных вирусом АЧС клетках). Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Н.П.Ашмарина и выражали в lg ГАЕ 50/см3.
- 5.4 Оценка дезинфицирующего действия средства «Триосепт- Эндо» in vivo
При исследованиях с вирусом, использовали вирулентный эпизоотически значимый вирус АЧС. На стерильные тест-объекты имитирующие объекты государственного ветеринарного надзора (впитывающие поверхности) наносили по 1,5 мл вируссодержащей жидкости на 100 см2. В качестве механической защиты вируса использовали стерильный свиной навоз в количестве 0,3 г., сухого вещества на 100 см2 поверхности, что составило 20% органических веществ в вируссодержащей жидкости. Перед нанесением на поверхность вируссодержащую суспензию тщательно перемешивали с соответствующим количеством навоза. Смесь равномерно распределяли на поверхности тестов, после чего их подсушивали 1 -2 часа. Испытуемые 0,5 — 3,0 %-ные растворы средства «Триосепт-Эндо» равномерно наносили методом орошения на тест-объекты, из расчета 0,3 л/м2 площади.
На контрольные тест-объекты, вместо раствора средства «Триосепт- Эндо» наносили такое же количество водопроводной воды, которая использовалась для приготовления раствора средства.
С обработанных растворами дезинфектанта тест-объектов, испытуемые материалы отбирали через 15 мин — 3,0 часа. Вирусный материал соскабливали, добавляли по 4,5 мл среды Игла-МЕМ, экстрагировали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугировали 15 минут при 3000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость сразу использовали для постановки биопробы на подсвинках. Биопробу проводили на 16 животных: 15 — опытных и 1 — контроль.
Наблюдение за инфицированными подсвинками проводили в течение 21 суток. Специфичность заболевания и гибели животных подтверждали методом обнаружения вируса АЧС в их крови в реакции аутогемадсорбции (адсорбция эритроцитов свиней на инфицированных вирусом АЧС клетках). Реакцию аутогемадсорбции ставили согласно ГОСТ 28573-90. Дезинфекцию признавали эффективной, если свиньи опытной группы оставались клинически здоровыми на протяжении всего периода наблюдения при гибели животных контрольной группы.
- 6 РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ
Антимикробную активность средства «Триосепт-Эндо» изучали в жидких и на твердых питательных средах с возбудителями колибактериоза и стафилококкоза с использованием белковой нагрузки и без нее.
Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли методом серийных разведений в ДТСБ с последующим высевом на ДТСА на чашках Петри.
В таблице 1 представлены результаты изучения бактериостатического и бактерицидного действия дезсредства «Триосепт- Эндо».
Таблица 1 — Антимикробная активность дезсредства «Триосепт-Эндо» в отношении Е. coli и S. aureus
| Тест- микроорг. | Вид действия | Белковая защита | Концентрация препарата, % от исходного | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |||
| Е. coli | б/с | нет | — | — | — | — | — | + | + | + | ||
| б/ц | — | — | — | — | — | + | + | + | ||||
| б/с | есть | — | — | — | + | + | + | + | + | |||
| б/ц | — | — | — | + | + | + | + | + | ||||
| S. aureus | б/с | нет | — | — | + | |||||||
| б/ц | — | — | + | |||||||||
| б/с | есть | — | — | — | — | — | + | + | + | |||
| б/ц | — | — | — | — | — | + | + | + | + | + |
Примечание: 1 — 0,5 %; 2 — 0,25 %; 3 — 0,125; 4 — 0,0625; 5 — 0,0312; 6 — 0,0156; 7 — 0,0078; 8 — 0,0039; 9 — 0,0019; 10 — 0,0009; «-» — роста нет; «+» — рост есть; б/с — бактериостатическое действие; б/ц — бактерицидное действие.
В результате проведенных испытаний установлено, что дезсредство «Триосепт-Эндо» обладает выраженной антимикробной активностью в отношении тест-культур грамотрицательных (Е. coli) и грамположительных (S. aureus) микроорганизмов в следующих концентрациях, принимая средство за 100 % вещество:
•МПК Е. coli — 0,0078 %;
•МБК Е. coli — 0,0078 %;
•МПК S. aureus— 0,0019%;
• МБК S. aureus — 0,0019%.
При добавлении высокомолекулярного белка происходит снижение бактерицидной активности средства в 4 раза.
При определении инфекционной активности вируса АЧС изолят Ставрополь в виде вируссодержащей крови установлено, что титр вируса в культуре клеток А4С2 составляет 7,00 lg ГАЕ50/мл (гемадсорбирующих единиц).
Дезинфицирующее действие 0,5-3,0 %-ных растворов средства «Триосепт-Эндо» в отношении вируса АЧС, которым были контаминированы впитывающие шероховатые тест-поверхности (бетон), определяли в экспериментах на свиньях. При этом норма расхода дезсредства при обработке тест-объектов составляла 0,3 л/м2.
Результаты испытаний дезинфицирующего действия дезсредства ^Триосепт-Эндо» в отношении вируса АЧС с использованием биопробы представлены в таблице 2.
Таблица 2 — Определение дезинфицирующего действия средства «Триосепт-Эндо» при обеззараживании тест-объектов из бетона, контаминированных вирусом АЧС в биопробе
| Конц-я раствора по препарату, % | Норма расхода, л/м2 | Экспозиция | Результаты заражения свиней смывами с тест-объекта бетон |
| пало/всего | |||
| 0,5 | 0,3 | 60 мин | 0/3 |
| 1,0 | 0,3 | 15 мин | 0/3 |
| 0,3 | 30 мин | 0/3 | |
| 0,3 | 120 мин | 0/3 | |
| Контроль | 1/1 |
Из данных таблицы 2 видно, что при орошении средством «Триосепт- Эндо» тест-объектов, контаминированных вирусом АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, поверхности из бетона обеззараживались 0,5 %-ным раствором (принимая исходный препарат за 100%) при экспозиции 1,0 час и 1,0 %-ным раствором при экспозиции 15 мин и более. Норма расхода дезсредства составляла 0,3 л/м2. Подсвинки этих опытных групп оставались клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения.
Контрольное животное пало на 7 сутки после заражения с характерной клинической картиной АЧС.
Дезинфектант «Триосепт-Эндо» по результатам лабораторных исследований обладает высокой бактерицидной и бактериостатической активностями в отношении тест-культур грамотрицательных (E. coli) и грамположительных (S. aureus) микроорганизмов обеспечивая их инактивацию при концентрациях 0,0078 и 0,0019 % от исходной, соответственно, без добавления белковой нагрузки.
При испытаниях на сельскохозяйственных животных (биопроба) установлено, что полное обеззараживание тест-поверхностей, имитирующих объекты государственного ветеринарного надзора (шероховатые впитывающие поверхности), контаминированных вирулентным эпизоотическим изолятом вируса АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза (20% органических веществ в вируссодержащей жидкости), было достигнуто при однократном орошении 0,5 %-ным раствором дезинфектанта «Триосепт-Эндо» при экспозиции 1,0 час и 1,0 %-ным раствором средства при экспозиции 15 мин и более при норме расхода дезсредства 0,3 л/м2. Дезинфицирующее средство «Триосепт- Эндо» обладает вирулицидным действием и рекомендуется для применения в очагах заражения АЧС для обработки объектов ветеринарного надзора в соответствии с «Правилами проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» (за исключением п.п. 9 и 10), утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ РФ 16.07.2002 г. с целью полной инактивации вируса АЧС и предотвращения его распространения.